Generell information

Inflammatoriska tarmsjukdomar omfattar en stor grupp av sjukdomar, exempelvis Crohns sjukdom och ulcerös kolit. Det är en kronisk inflammation i tarmslemhinnan som orsakar buksmärta, blodig avföring och viktnedgång. Bakomliggande orsaker är oklara men en onormal aktivering av kroppens immunsystem, störningar i mikrobiomet och i tarmens barriärfunktion i genetiskt predisponerade individer anses spela avgörande roll. Inflammationen kan också leda till extraintestinala symptom och tumörutveckling.

Aktuellt projekt syftar till att öka kunskapen kring hur immunceller rekryteras till tarmen och hur samspelet mellan mikrobiomet och immunsystemet fungerar. Detta i avsikt att kunna förebygga sjukdom och att utveckla nya cellulära behandlingsterapier. Möss, inklusive genetiskt modifierade med avseende på utveckling av tarminflammation, används. Ett flertal olika modeller för tarminflammation och tumörutveckling används i kombination med manipulation av immunsystemet och/eller mikrobiomet. De använda modellerna är etablerade och orsakar tarminflammation med blodig avföring och viktnedgång.

Projektet bedömdes vara av avsevärd svårhetsgrad och vid utvärdering i efterhand angavs att följande aspekter särskilt skulle utvärderas:

1. Hur många djur som uppnått avbrytningspunkt och vilken avbrytningspunkt.
   Svar: Knappt 5% uppnådde avbrytningspunkten, främst p.g.a. kraftig viktförlust, svår diarré, blod i avföringen eller uttalad rektal prolaps.
2. Har det varit möjligt att undvika 25% viktminskning genom att använda de djur som minskat mest i vikt till tidigare slutpunkter?
   Svar: Försöksledaren anser att eftersom kolit inducerad av DSS (dextran-sulfatnatrium; framkallar på kemisk väg kolit) utvecklas olika i olika djur så är tidiga tecken på viktminskning inte en bra enskild parameter för att för-utsäga en fortsatt försämring – vissa djur stabiliseras utan att överskrida tröskeln på 25 % viktminskning.
3. Har det varit möjligt att använda någon smärtlindring innan eller efter injektion i tramp-dyna?
   Svar: Försöksledaren anser att analgetika/antiinflammatoriska läkemedel riskerar att störa det experimentella utfallet då det har rapporterats att opioidanalgetika (t.ex. buprenorfin) påverkar induktionen av fördröjd överkänslighetsreaktion i huden (Elliott et al. 2003 & 2006), vilket är projektets viktigaste avläsning i modellen för oral immunologisk tolerans. ”Barrier wound care spray med smärtlindring” användes som smärtlindring.
4. Är annan mindre irriterande adjuvans än CFA (complete freund´s adjuvant) möjlig att använda vid dessa försök?
   Svar: Att byta ut CFA till annat adjuvans ansågs inte möjligt.
5. Har tillsynen varit tillräcklig för att förhindra att avbrytningspunkter överskridits eller att djur självdött?
   Svar: Försöksledaren anser att övervakningsrutinerna har varit tillräckliga för att förhindra att djur uppnådde avbrytningspunkterna eller avled spontant. En ökad övervakningsfrekvens uppges vara avgörande under den kritiska inflammatoriska fasen, särskilt under de 7 dagar långa DSS-cyklerna. I AOM/DSS-modellen (AOM=azoximetan; framkallar tarmtumörer i kombination med DSS exposition) upptäcktes fall av misstänkt hepatotoxicitet och tidig död efter AOM-administrering. Som ett resultat av dessa observationer infördes förbättrade övervakningsprotokoll under denna period.

Antal sökta djur och antal använda djur

Tillståndet omfattade 15 000 möss. Av dessa användes totalt 11 844 varav 7 222 i avel och 4 622 i experiment.

Bedömning av svårhetsgrad

De 4 622 möss som användes i experiment förvarades på två olika försöksdjursanläggningar. Vid en av dessa anläggningar kunde uppgifter om djurens (n=2 062) svårhetsgrad och antal djur som uppnådde avbrytningspunkt (n=92) erhållas i efterhand. För den andra kunde endast uppgifter om antal djur i försök (n=2 560) erhållas. För mössen i den förstnämnda anläggningen bedömdes lidandet för 1 468 djur (70%) ha varit av avsevärd svårhetsgrad. Denna bedömning grundas på viktnedgång, blodig avföring, förekomst av prolaps och nedsatt aktivitet. För de övriga 30% av mössen bedömdes svårhetsgraden vara ringa eller terminal.

Knappt 5% av djuren i försök uppnådde avbrytningspunkten. Detta hände främst djur som ingick i försök som omfattade kolit och koloncancer och orsaken var kraftig viktförlust, svår diarré, blod i avföringen eller uttalad rektal prolaps.

Måluppfyllelse

Fem vetenskapliga artiklar har publicerats i välrenommerade internationella tidskrifter. Dessa beskriver bl.a. att:

Den metabola liver X receptor-signalvägen reglerar både regeneration och tumörutveckling i tarmen. Denna signalväg skulle kunna utnyttjas för att främja regeneration av skadad tarm vid inflammatorisk tarmsjukdom, utan att öka risken för att utveckla cancer.

Nya protokoll för spatial-omics-analys från mun till ändtarm i mus har utvecklats, vilket gör att hela musens mag-tarmkanal nu kan undersökas. Detta gör det möjligt att hitta nya regionsspecifika mekanismer för sjukdomsinitiering och läkning.

En ny terapeutisk målcell för inflammatorisk tarmsjukdom, B-lymfocyter, har studerats. Dessa är immunceller som stör processen för läkning av tarmslemhinnan vid tarminflammation.

3R

Följande åtgärder för att förbättra djurens välfärd implementerades under experimentens gång:

• Att utföra procedurer på morgonen förbättrade effektiviteten i djurhanteringen och minskade stress.
• Förhandshantering (2–3 dagar innan), inklusive öronmärkning, byte från vattenpåsar till flaskor med pip och daglig vägning, minskade avsevärt stressen under de experimentella procedurerna.
• Våt mat placerades i buren när mössen förlorade i vikt. Detta ökade födo-intag i kolitmodeller.
• Koncentrationen av DSS i dricksvattnet har minskats eller justerats för musstammar med särskilt hög känslighet för kolit. Att dynamiskt justera DSS-koncentrationen inom ett intervall på 1,5 %–3 % under varje cykel, baserat på tidiga tecken på kroppsviktsminskning eller andra kliniska symptom, hjälpte till att bättre modulera sjukdomsutvecklingen och minska onödigt lidande.
• Tillsynsschemat för djur i DSS/AOM modellerna har optimerats vilket gör att sjuka djur tidigare upptäcks. I AOM-DSS-modeller visade det sig viktigt med förstärkt övervakning under dagarna efter AOM-injektionen – innan DSS-cyklerna – på grund av risken för tidiga negativa effekter, såsom misstänkt levertoxicitet.
• AOM-dosen (10 µg/g kroppsvikt) har delats upp i två separata injektioner på 5 µg/g som ges med tre dagars mellanrum. I och med detta har inga tecken på levertoxicitet eller tidig död observerats.

Övriga kommentarer

Ansökan beviljades med följande villkor:

• Att vid injektion i trampdyna ska smärtlindring användas före injektion, om möjligt, eller efter sista mätning.
• Att avbrytning vid tumörförsök sker vid 15% viktminskning eller vid BC2+ (”body conditioning score”; forskargruppens interna sjukdomsbedömningssystem) med undantag av tumörförsök inducerade av DSS-behandling där avbrytning sker vid 25% viktminskning eller BC2.
• Att avbrytning sker vid mer än 4 poäng totalt eller 3 poäng på enskild kategori enligt forskargruppens eget sjukdomsbedömningssystem.

Försöksledaren uppger att dessa villkor har efterföljts och att det inte negativt har påverkat genomförandet av projektet. Som smärtlindring i trampdyna vid injektion har ”barrier wound care spray med smärtlindring” använts.

Problemet med att erhålla exakta uppgifter om vilken svårhetsgrad och eventuell avbrytningspunkt som enskilda djur uppnådde från en av de två använda försöksdjursanläggningarna har åtgärdats. Programvaran för registrering och rapportering har korrigerats så att slutpunktsregistrering framöver kommer att vara tillgängligt.

Etablerad rapportstandard