Generell information

Angiogenes och lymfangiogenes är de processer då nya blodkärl och lymfkärl bildas från befintliga kärl. Angiogenes är en viktig funktion och sker normalt i kroppen för att öka syresättningen i t.ex. aktiv vävnad men den bidrar även i patologiskt tillstånd såsom i tumörtillväxt. Kärlen är viktiga för både tumörtillväxt och metastasering då det transporterar näringsämnen och syre till tumörvävnaden och de hjälper tumörer att sprida sig till andra delar av kroppen genom metastas.
Cancerterapi inkluderar ofta åtgärder som påverkar kärlnybildning (angiogenes) men man har sett att cancertumörer utvecklar resistens mot angiogeneshämmande behandlingen vilket gör att behandlingen inte blir effektiv. I projektet ville försöksledaren studera de molekylära mekanismer som gör att angiogenes- och lymfangiogenesresistens utvecklas för att kunna förbättra denna typ av behandling.

I tidigare studier under andra etiska tillstånd har man visat hur angiogenes-/lymhangiogenesreglerande molekyler (dvs. PlGF, PDGF, IL33, FGF, erytropoietin, TNFa, VEGFB etc.) har främjat tumörtillväxt och metastas och hur anti-angiogena terapier hämmade dessa molekyler.

Syftet med denna studie är att ytterligare öka förståelsen för hur blodkärlstillväxten (angiogenes) och lymfkärlstillväxten (lymfangiogenes) reglerar tillväxten av primära och metastatiska tumörer hos möss.

Framförallt ville man fokusera på angiogena faktorer som angiostatin, VEGF och PDGF för att försöka förbättra förståelsen för hur kärltillväxt påverkar tumörprogression och motståndskraft mot behandling.

Två specifika syften med studierna var:

1. Studera nyckelmolekyler involverade i reglering av tumörkärl och metastaser.
2. Utforska mekanismer för resistens mot anti-angiogena och anti-lymfogena terapier.

Avsikten är att undersöka hur angiogenes och lymfangiogenes stimuleras eller hämmas av molekyler som angiostatin, VEGF, PDGF och andra substanser samt hur detta påverkar tumörtillväxt och metastasering.

Det övergripande målet är att öka förståelsen för hur man botar cancerpatienter genom behandlingar som riktar sig mot tillväxt av blodkärl (angiogenes).

Antal sökta djur och antal använda djur

Tillståndet omfattade 30000 djur varar 405 djur användes. Anledningen till att inte fler djur användes var att man hade ett annat tillstånd och att man på grund av renovering tvingades flytta till en annan avdelning.

Man har använt Wt (wild type) och Tg (Transgenic) möss i studien, Tg mössen var SCID och NSG (NOG) (immunodefekta).

Bedömning av svårhetsgrad

Försöksledaren klassade sin etiska ansökan i sin helhet i graden avsevärd svårhetsgrad och nämnden fastställde detta i det godkända etiska tillståndet.

Av de 405 djuren som användes uppnådde 249 djur avsevärd svårhetsgrad, 123 djur måttlig svårhetsgrad, 33 djur ringa svårhetsgrad.

Antalet djur inkluderar inte djur som avlats fram men inte använts i försöken.

Djuren användes i följande undergrupper in det etiska tillståndet:

• 4.2, Studie av angiogenesreglerande faktorer i interna tumörorgantransplanterade modeller
• 4.3, Studie av angiogenesreglerande faktorer i subkutana tumörxenotransplantat modeller
• 4.6.2, Studie av angiogenesreglerande faktorer inducerade bukmetastasmodeller
• 4.8.4, Studie av värdcellsinteraktion i tumörtillväxt och metastasering, diet och utfodring och en kombination av 4.2 och 4.8.4 i det etiska tillståndet.

Nämnden ville ha en utvärdering av följande:

1. Hur påverkas djuren av en större tumörbörda? Vilka symptom/smärtpåverkan kan ses hos djuren tills avbrytning- eller slutpunkt nås?
   Svar: Man observerade inga andningsproblem orsakade av potentiella lungmetastaser. I subkutana tumörbärande möss var de vanligaste symtomen relaterade till huden, såsom utveckling av lindriga sår på tumörstället, ibland poäng mellan 0,1 och 0,2 på KI-mallen. För intraorgan eller ortotopiska modeller övervakades postoperativa komplikationer som mindre sår. Alla djur kontrollerades dagligen för att säkerställa korrekt läkning utan infektion eller långvarigt obehag.
2. Utvärdering av tumörutvecklingen samt metastasutvecklingen i varje tumörmodell, hur snabbt växer tumörerna och metastaserna och var? När ses påverkan på djuren? Hur länge är djuren påverkade?
   Svar: I vissa fall observerades tumörutveckling som små knölar inom tre dagar efter cancercellsinjektion i ryggmodeller. Tumörerna hade nått full storlek inom 3 till 14 dagar. För metastasering användes en spontan metastaserande modell som involverade kirurgiskt avlägsnande av primära subkutana tumörer. I denna modell kan metastaserande tumörtillväxt bli synlig i lungorna efter cirka åtta veckor efter avlägsnande av primär tumör, med enstaka metastaser i lymfkörtlar och mer sällan i levern. Man observerade dock inga levermetastaser i studierna. Lungmetastaser nådde vanligtvis en maximal storlek på 1 mm, och inga tecken på lungdysfunktion observerades.
3. Lämpligt tillsynsschema för de olika tumörmodellernas utveckling utifrån tumörpåverkan på djuren. Hur ofta behövs tillsyn för att säkerställa att djur avlivas direkt vid påverkad andning eller uppnådd avbrytningspunkt?
   Svar: Man ökande frekvensen av kontrollerna i tumörimplantationsexperimenten. Det var till exempel tre till fyra gånger i veckan efter att ha kunnat observera den palpabla tumören och fram till slutpunkten. Extra tillsyn, 4-5 gånger per vecka, mot slutet av experimentet. För den ortotopiska tumörmodellen övervakade vi de tumörbärande mössen minst en gång i veckan under de första 3 veckorna. Sedan ökade frekvensen tre till fyra gånger i veckan mot slutet av experimenten. Som överenskommits med nämnden sattes ytterligare extra tillsyn in två gånger om dagen på morgonen och kvällen för mössen som riskerade att få andningspåverkan. Dessutom övervakades djur som närmade sig avbrytningspunkten flera gånger om dagen och på natten.
4. Hur många djur har nått avbrytningspunkt före slutpunkt och vilka avbrytningspunkter har uppnåtts?
   Svar: Tre möss uppnådde de uppsatta avbrytningspunkterna och togs ut ur studierna. Två på grund av skador från slagsmål och en på grund av sår från konstant grooming i den HFD-inducerade fetmamodellen. Försöksledaren anger att man försökt förebygga slagsmål genom att utöka berikningen och för HFD modellen ökade man frekvens på rengöring av burarna.
5. Vilka försöksspecifika avbrytningspunkter utöver KI-mallen kan användas för de olika tumörmodellerna/försöksuppläggen för att minska djurens lidande?
   Svar: Man baserar sina avbrytningskriterier dels på lång erfarenhet från tidigare studier och gränserna är satta utifrån KI-mallen (maximal 0,4, utan en individuell parameter som överstiger 0,1) och tumörstorleksgränser för att säkerställa minimalt lidande. Man har daglig övervakning av tumörbärande möss och konsulterade veterinär när man ville ha en ytterligare bedömning av djurens hälsa och välbefinnande.

Måluppfyllelse

Försöksledaren anger att man delvis uppnått målen. Man anger att man sett en metabolisk aktivering som involverar blodkärl vid behandling av metabola störningar. De djupa bakomliggande mekanismerna och effekten på metastaser är dock fortfarande okända och behöver mer utredning.

Resultaten har publicerats i tre internationella vetenskapliga tidskrifter. Man hänvisar i publikationerna dels till det nu utvärderade etiska tillståndet och till etiska tillstånd från universitetet i Fudan, Kina, eller Institutional Animal Care and Use Committee at the Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical

Sciences. Men de rapporterade djuren är alla använda under det svenska utvärderade tillståndet.

3R

Man anger att man i samarbete med djurhuspersonalen förbättrade miljöberikningen genom att lägga till extra träpinnar, hus och papper för att skapa en mer stimulerande miljö vilket förhoppningsvis skulle reducera risken för slagsmål. Man ökade också rengöringsfrekvensen för experiment där man inducerade fetma hos mössen.

Följande villkor sattes upp av den regionala nämnden:

1. Att djurens påverkan ska bedömas enligt KI-mallen, grimasskala samt Body Condition Score minst varannan dag efter försöksstart och dagligen när symptom/poäng uppstått.
2. Att djur som riskerar andningspåverkan ska ha extra tillsyn av andningen direkt på morgonen och strax innan personal lämnar djurhuset för kvällen.
3. Att djur som närmar sig avbrytningspunkt ska ha tillsyn flera gånger dagligen samt nattetid om djuret riskerar nå avbrytningspunkt under natten.
4. Att djur avlivas som får oväntade symptom eller uppvisar beteenden som inte ger utslag på KI-mallen men som medför lidande/smärta eller på annat sätt har en negativ effekt på djurens välbefinnande.
5. Att avbrytningspunkt enligt KI-mallen för djur före försök är 0,4 och för djur i försök är 0,5 poäng eller 0,4 på enskild parameter/kriterium med undantag för angivna undantag som finns i ansökan och komplettering.
6. Att djur utöver angivna undantag från KI-mallen i ansökan/komplettering får ha en samlad poäng om 0,4 (max 0,1 på enskild parameter/kriterium) enligt KI-mallen i max två veckor.

Detta verkar dock inte ha påverkat försöken.

Övriga kommentarer

En omfattande ansökan med 17 undergrupper där endast lite mer än 1% av djuren som godkändes användes.
Ansökan godkändes efter två frågeomgångar, den första med 30 frågor och den andra 14 frågor.

En reservation lämnades in vid handläggning hos den regionala nämnden med samma argument som ofta framförs:
”För att kunna göra en etisk bedömning av en ansökan behöver nämnden en tydlig bild av hur djuren kommer påverkas av försöken för att kunna bedöma lidandet mot nyttan”.

Etablerad rapportstandard